Archive - 2008

February 4th

DNA-Extraktionssystem GeneMole eingeführt

Chemie
04.02.08   von  
Die norwegische <a href=http://www.molegenetics.com>Mole Genetics</a> hat das automatisierte DNA-Extraktionssystem GeneMole europaweit eingeführt. Mit GeneMole soll eine "Low-Throughput" DNA-Aufreinigung in jedem Labor möglich werden. DNA-Extraktionssystem GeneMole eingeführt <% image name="Mole_GeneMole" %><p> <small> Das kompakte Instrument ist ab 9.500 € zu haben, vermarktet wird es von VWR. </small> GeneMole ist ein vollautomatisches System, dessen Roboter bis zu 16 Proben gleichzeitig bedienen kann. Die Proben werden in ein Rack geladen und danach vom Roboter in versiegelte MoleStrips übergeführt, welche mit den Reagenzien vorgefüllt sind. Diese Einwegbehälter verhindern ein Crossover bzw. Kontaminationen. Die Probenvolumina reichen von 50-200 µl. Das via Touch-Screen zu bedienende Gerät ist binnen 3 min installiert. Die Aufreinigung basiert auf magnetischen Kügelchen ("Beads"), sodass hochqualitative Nukleinsäuren für weitere Downstream-Anwendungen innerhalb von 40 min zur Verfügung stehen.

HenaLine: Neue Drehschieberpumpen von Pfeiffer

Chemie
04.02.08   von  
<a href=http://www.pfeiffer-vacuum.net>Pfeiffer Vacuum</a> hat mit der HenaLine eine neue Reihe ölgedichteter Drehschieberpumpen eingeführt, die sowohl für Anwendungen in der Industrie als auch in der Forschung geeignet sind. Sie erzeugen ein Vakuum mit einem Saugvermögen von 25-1.000 m³/h. <% image name="Pfeiffer_Vacuum_HenaLine" %><p> <small> Die neuen Pumpen sind als Einzelpumpe oder als Vorpumpe einsetzbar. </small> Als Vorpumpe in Wälzkolben-Pumpständen sind sie ideal für Anwendungen in der Metallurgie, der Helium-Lecksuche oder der Vakuumtrocknung und -entgasung. Die niedrige Betriebstemperatur erhöht die Standzeit des Öls und die Pumpe kommt ohne zusätzliche Wasserkühlung aus. Ölnebelabscheider, Ölrückführung und Sicherheitsventile sind serienmäßig integriert. Sie verhindern eine Verschmutzung der Umgebungsluft und schützen sowohl die Pumpe als auch die Anlage. Durch das Gasballastventil wird darüber hinaus ein Abpumpen von Wasserdampf und anderen Prozessdämpfen gewährleistet. HenaLine: Neue Drehschieberpumpen von Pfeiffer

February 3rd

QVE1901: Neuer Strömungswächter von Siemens

Chemie
03.02.08   von  
Für anspruchsvolle Betriebsbedingungen ist der neue Strömungswächter QVE1901 aus dem „Symaro“-Fühlersortiment von <a href=http://www.siemens.de>Siemens</a> konzipiert: Geeignet für einen hohen Druckbereich (bis zu 25 bar), gegen Verschmutzung oder Vereisung kaum empfindlich und Entzinkung resistent. Seine Schaltpunktgenauigkeit bleibt über die gesamte Lebensdauer erhalten. <% image name="Siemens_Stroemungswaechter" %><p> <small> Der Trockenlaufschutz des QVE1901 führt zum automatischen Abschalten eines Motors. </small> Der neue Sensor verfügt er über einen Reedkontakt, der mit einem Magnetfeld berührungslos schaltet. Deshalb bleibt der Schaltpunkt stabil, im Gegensatz zu Produkten mit Mikroschaltern, deren Rückstellfedern altern. Zudem bleibt dank einer Glasfaserverstärkung das Paddel stabil und lagert keinen Kalk an, wobei die Länge des Paddels bequem mit einer kleinen Zange auf das gewünschte Maß gekürzt werden kann. Der QVE1901 eignet sich für die Einbindung in Gebäudeautomationssysteme, hilft Energie zu sparen und Schäden durch Feuchtigkeit zu verhindern. Denn in Kombination mit Druckerhöhungspumpen steuert er die bedarfsgerechte Zuschaltung und gewährleistet den erforderlichen Wasserdruck im System. Sein Trockenlaufschutz führt zum Abschalten eines Motors, wenn kein Durchfluss vorhanden ist, und in schnellen Durchlauferhitzern wird der Heizer nur gestartet, wenn Wasser entnommen wird. QVE1901: Neuer Strömungswächter von Siemens

February 2nd

Die Vorzüge der Npro-Fusionstechnologie

Life Sciences
02.02.08   von  

Die Forschungsarbeit von Clemens Achmüller an der Universität Innsbruck wurde Ende 2007 mit dem vom Chemie Report vergebenen <a href=http://chemiereport.at/chemiereport/stories/7026>ALSA 2007</a> belohnt. Der junge Tiroler beschreibt, wie die Produktion von Proteinen dank der N<small>pro</small> Fusionstechnologie mit authentischen N-Termini in E. coli möglich ist. <table> <td> Gentechnisch veränderte Kolibakterien werden wegen der guten genetischen Charakterisierung und der schnellen Ansammlung von Biomasse seit Jahrzehnten für die industrielle Produktion therapeutische Proteine verwendet. Jedoch unterscheiden sich die Proteine aus den Bakterien leicht von denen höherer Zellen: die bakterielle Proteinsynthese beginnt nämlich mit formyl-Methionin anstatt Methionin. Die Formylgruppe wird durch Deformylasen und das Methionin durch Amino-Peptidasen entfernt. Werden rekombinante Proteine überexprimiert, entsteht eine heterogene Mischung in Bezug auf deren N Terminus, weil beide Reaktionen sehr ineffizient sind. </td> <td><% image name="ALSA_Achmueller" %></td> </table><p> <small> Clemens Achmüller bei der Verleihung des ALSA 2007. Seine Forschungsarbeit hat bei Sandoz und Boehringer Ingelheim für hohe Produktivitätssprünge gesorgt. © Thomas Preiss </small>

 

Aufwendige und teure Downstream Processing Schritte sind nötig, um das gewünschte Produkt hochrein zu erhalten. Gelingt dies nicht, wird die Zulassung des Medikamentes durch die Gesundheitsbehörde blockiert, da es im Patienten zu unerwünschten Immunreaktionen oder zu einer veränderten Pharmakokinetik kommen kann. Zurzeit werden so genannte Fusions-Tags verwendet, welche anschließend durch chemische oder enzymatische Spaltung entfernt werden, um den homogenen N-Terminus zu erhalten. Da zuerst ein Enzym zugeben werden muss, um es dann gemeinsam mit dem abgespaltenen Tag wieder zu entfernen, wird der gesamte Prozess verteuert. Unerwünschte Spaltungen innerhalb des Zielproteins und unvollständige Entfernung des Tags können den Produktionsprozess verlangsamen und die Kosten weiter nach oben treiben. Verwendung von N-terminalen Signalsequenzen, um das Zielprotein ins Periplasma zu treiben ist ein weiterer gängiger Ansatz. Nach erfolgter Translokation werden die Signalsequenzen enzymatisch abgespalten, jedoch sind die Produktausbeuten sehr gering. Effizientere Methoden sind zurzeit noch rar. Erst kürzlich wurden so genannte Inteine (Protein Splicing Elemente) als selbst-spaltende Tags eingeführt. Über deren industriellen Einsatz gibt es zurzeit noch keine Berichte und die Ausbeuten scheinen ebenfalls nicht sehr hoch zu sein. Das <a href=http://www.acbt.at>Austrian Center of Biopharmaceutical Technology</a> nutzt Synergismen zwischen universitären Instituten (Institut für angewandte Mikrobiologie der BOKU Wien und Institut für Biochemie der Universität Innsbruck) und Industrie (Sandoz, Boehringer Ingelheim und Ionimed), um effizientere und schnellere biopharmazeutische Produktionsprozesse zu entwickeln. Es sollte unter anderem ein neuartiges prokaryotisches Expressionssystem entwickelt werden, mit dem der gewünschte N Terminus auf einfache und effiziente Weise erhalten werden kann. Die Forscher des Kompetenzzentrums versuchten die Autoprotease N<small>pro</small> (168 Aminosäuren) vom Schweinepestvirus als selbstspaltenden Fusions-Tag für die biotechnologische Anwendung zweckzuentfremden (N<small>pro</small> Fusionstechnologie). Dabei will man das gewünschte Zielprotein als Fusionsprotein mit N<small>pro</small> in sog. Inclusion Bodies (IB), inerte unlösliche Proteinaggregate exprimieren, um auch toxische Proteine und Peptide herstellen zu können. Peptide werden normalerweise im Bakterium proteolytisch abgebaut. Somit dient die Autoprotease als N-terminale Schutzkappe welche das therapeutische Protein zunächst in Inclusion Bodies treibt, um es vor unerwünschten chemischen oder enzymatischen Modifikationen zu schützen. Nachdem die Fusionsproteine aufgereinigt wurden, wird die autoproteolytische Aktivität von N<small>pro</small> durch so genanntes in vitro Protein Refolding aktiviert, um das Zielprotein mit authentischen N-Termini freizusetzen (siehe Abb. 1). Bei der Umsetzung der geplanten Strategie mussten die Forscher mit einer Reihe von Problemen kämpfen: N<small>pro</small> war von Natur aus für die Funktion im Schweinepestvirus optimiert und schien gänzlich ungeeignet für eine biotechnologische Anwendung. Im natürlichen Wirt spaltet sich N<small>pro</small> co-translational vom viralen Polypeptid ab, das genaue Gegenteil von der geplanten Expression des Fusionsproteins in den Bakterien. Außerdem konnte eine Reihe von Proteinen nicht abgespalten werden, da N<small>pro</small> sehr unlöslich ist und gemeinsam mit dem Fusionspartner während dem Protein Refolding präzipitierte. Das ambitionierte Projekt stand auf sehr wackeligen Beinen und ein Abbruch des Projektes stand im Raum. Wir von der Arbeitsgruppe um Bernhard Auer vom Institut für Biochemie der Universität Innsbruck haben versucht, die physiko-chemischen Eigenschaften der Autoprotease (Anzahl Cysteine, isoelektrischer Punkt, aliphatischer Index) durch ortsgerichtete Mutationen und anschließendem Screening zu verändern („Protein Engineering“). Wir konnten eine verbesserte N<small>pro</small> Mutante (EDDIE) mit reduzierter Tendenz zur Aggregation generieren [1]. <% image name="Achmueller_Grafik" %><p> <small> Abb. 1. Schema der Npro Fusionstechnologie: Das Gen für das gewünschte Zielprotein wird an das Npro Gen fusioniert, in einen Expressionsvektor kloniert und in E. coli Zellen transformiert. Expression der Fusionsproteine als Inclusion Bodies (IB) und anschließende Isolation der IB. Chaotrop (strukturzerstörend) wirkende Agentien werden benötigt, um die aggregierten Fusionsproteine aufzulösen. Durch in vitro Refolding (Änderung der Bedingungen von chaotrop zu kosmotrop; strukturausbildend) wird die Autoprotease aktiviert und befreit das Zielprotein (Target) mit dem gewünschten N-Terminus (X169, X steht für alle proteinogenen Aminosäuren, außer Prolin). </small> Erst jetzt war es möglich eine Reihe von Proteinen abzuspalten, welche von der Wildtyp Autoprotease nicht befreit werden konnten. Weiters hatte EDDIE eine geringere Aktivität in der bakteriellen Zelle und wies in vitro eine generell erhöhte Spaltungsrate (bis zu 95 %) und -kinetik auf. Wir konnten auch zeigen, dass alle proteinogenen Aminosäuren (außer Prolin) direkt nach der Spaltstelle eingesetzt werden können. Somit kann EDDIE als universeller Tag verwendet werden. Zusätzlich können mit Hilfe dieser neuen Technologie toxische Proteine und Peptide in E. coli in hoher Ausbeute (bis zu 12 g/l) produziert werden. Aufgrund der Neigung von EDDIE Inclusion Bodies zu bilden, können neue Produktionsprozesses innerhalb kürzester Zeit entwickelt werden, da dies für jedes Zielprotein gleichermaßen gilt. Forscher um Alois Jungbauer vom Institut für Angewandte Mikrobiologie an der BOKU Wien versuchen gerade, Peptide mit Affinität gegen die veränderte Autoprotease EDDIE unter chaotropen Bedingungen zu entwickeln, um die Aktivierung des Enzyms auf einem Affinitätsmaterial unter hohen Proteinkonzentrationen durchzuführen. Angewendet wird die <small>Npro</small> Fusionstechnologie bereits von Sandoz und Boehringer Ingelheim Austria. Insgesamt konnten diese beiden Unternehmen auf Anhieb eine bis zu 40-fache Steigerung der Gesamtproduktivität im Vergleich zu einer konventionellen Produktionsstrategie erzielen. <small> Referenz: [1] C. Achmüller, W. Kaar, K. Ahrer, P. Wechner, R. Hahn, F. Werther, H. Schmidinger, M. Cserjan-Puschmann, F. Clementschitsch, G. Striedner, K. Bayer, A. Jungbauer, & B. Auer. Npro fusion technology to produce proteins with authentic N termini in Escherichia coli. Nature Methods. 2007 Dec; 4(12):1037-1043. </small>

Mehr als nur „Chlorophyll-Müll“

Chemie
02.02.08   von  
Kaum ein biologisches Phänomen ruft ein solch eindrucksvolles Farbspektakel hervor wie der herbstliche Chlorophyll-Abbau, der gelbe und rote Pigmente zutage treten lässt. Der grüne Farbstoff verschwindet allerdings nicht nur aus Blättern, sondern auch aus einem für die Jahreszeit typischen Nahrungsmittel: dem Obst. Innsbrucker Chemiker haben nachgewiesen, dass in reifen Früchten und bunten Blättern exakt dieselben Chlorophyll-Abbauprodukte zu finden sind. <i>Carola Hanisch</i> <% image name="Ahornblatt" %><p> <small> Das grüne Pigment wird in bunten Blättern und reifem Obst zu farblosen antioxidativen Substanzen abgebaut. </small> Chlorophyll ist eines der wichtigsten Moleküle des Lebens, dient es doch zur Photosynthese, also zur Umwandlung von Wasser und Kohlendioxid zu Glucose. Dabei setzt es Lichtenergie sehr effizient in chemische Energie um. Im Herbst, wenn die Pflanzen Nährstoffe aus ihren Blättern zurück gewinnen, verschwindet auch das Chlorophyll. Jährlich werden riesige Mengen des grünen Blattfarbstoffs abgebaut: Rund 1 Mrd t weltweit. Erstaunlicherweise war es lange Zeit völlig unklar, auf welche Weise dies geschieht und welche Endprodukte dabei entstehen. Erst vor einigen Jahren konnten Bernhard Kräutler vom Institut für Organische Chemie der Uni Innsbruck gemeinsam mit Züricher Botanikern den Chlorophyllabbau-Weg aufklären und die sogenannten nichtfluoreszierenden Chlorophyll-Kataboliten (NCCs) als Endprodukte identifizieren. Sie entstehen jedes Jahr in denselben Massen, in denen Chlorophyll verschwindet. Da sie aber farblos sind, fällt dies nicht weiter auf. Die NCCs werden – zumindest in den Blättern – nicht weiter abgebaut. Sie bleiben im Blatt, bis dieses abfällt und schließlich von Mikroorganismen zersetzt wird. Dass die grüne Farbe verloren geht, liegt am weitreichenden Umbau des Chlorophyll-Gerüsts. Der grüne Blattfarbstoff ist ein viergliedriger Ring, ein Tetrapyrrol, dessen Glieder selbst auch ringförmige Moleküle sind, die Pyrrole. In der Mitte des Chlorophylls befindet sich ein Magnesiumion und außen ist eine lange, fettliebende Seitenkette angeknüpft. Bei den NCCs hingegen fehlen sowohl die Seitenkette als auch das Magnesium. Zwar sind die vier Pyrrole weiterhin miteinander verbunden, doch nur noch als Kette: Der Ring ist an einer Stelle aufgebrochen. Dass die Pflanze überhaupt die Energie aufwendet, Chlorophyll in NCCs umzuwandeln, ist eine reine Schutzmaßnahme. Chlorophyll ist zwar – in Proteine eingebunden – ungeheuer nützlich, in freier Form aber phototoxisch – der Pflanze drohen Lichtschäden. Da die schützenden Proteine des Blattes im Herbst abgebaut werden, muss auch das Chlorophyll „entschärft“ werden. Es wird solange umgewandelt werden, bis es photochemisch harmlos ist. Dies ist nach mehreren Zwischenstufen bei den NCCs schließlich der Fall. Dass diese Inhaltsstoffe verfärbter Blätter auch in Früchten vorkommen, war bisher nicht bekannt. Nun haben Kräutler und seine Mitarbeiter die NCCs auch in den Schalen und im nahe der Schale gelegenen Fruchtfleisch von reifen Äpfeln und Birnen gefunden, nicht aber in unreifen Früchten. Damit wird erstmals gezeigt, dass der Abbauweg des Chlorophylls in Blatt und Früchten gleich verläuft. Das war bisher nur Spekulation“, sagt Kräutler. Allerdings gibt es auch einige Unterschiede zwischen Blatt und Frucht. Zunächst einmal ist die Chlorophyll-Menge pro Gramm eines Blattes viel größer als in der Obstschale. Außerdem wird das Chlorophyll im Blatt nahezu vollständig zu NCCs abgebaut. Im Obst fanden die Innsbrucker allerdings nur NCCs, die etwa einem Zehntel des in unreifen Früchten vorhandenen Chlorophylls entsprechen – was den Forschern noch Rätsel aufgibt. Kräutler und seine Mitarbeiter gaben sich nun aber nicht damit zufrieden, die NCCs als reine Abfallprodukte des Chlorophyllabbaus zu betrachten und suchten nach einem Hinweis auf eine mögliche Funktion. Dabei fiel ihnen auf, dass die NCCs in ihrer Struktur dem Bilirubin ähneln, dem Abbauprodukt des Häms. Häm ist Teil des sauerstofftransportierenden Blutfarbstoffs Hämoglobin. Es ist ebenfalls ein Tetrapyrrol, allerdings im Gegensatz zu Chlorophyll mit einem Eisenion in der Mitte statt des Magnesiums. In letzter Zeit hat sich herausgestellt, dass Bilirubin nicht nur ein Abfallprodukt des Hämabbaus ist, sondern auch eine zellschützende Funktion im lebenden Organismus ausübt. Es ist ein hochwirksames Antioxidans. Antioxidantien verhindern, dass aggressive Radikale empfindliche Substanzen wie zum Beispiel Fettsäuren in Zellmembranen zerstören. Thomas Müller aus Kräutlers Gruppe wandte denjenigen Standard-Labortest an, der auch schon beim Bilirubin benutzt worden war, und stellte ebenfalls antioxidative Eigenschaften der NCCs fest. Sie waren in der Lage, die radikalische Oxidation der Fettsäure Linolsäure deutlich zu verringern, wenn auch nicht ganz so stark wie das Bilirubin. Somit reihen sich die NCCs, die seit jeher Bestandteil menschlicher Nahrung sind, in die Gruppe der im Obst enthaltenen Antioxidantien ein, zu denen beispielsweise auch die Vitamine C und E zählen. Unter den Antioxidantien gelten bislang die Flavonoide als besonders wertvoll. Ob die NCCs zu der gesundheitsfördernden Wirkung von Früchten beitragen, ist damit noch nicht geklärt. Unklar ist auch noch, zu welchem Zweck das Chlorophyll im Obst zu antioxidativen Substanzen abgebaut wird. Kräutler vermutet, dass die Früchte, die ja die Samen enthalten und somit für die Vermehrung der Pflanze verantwortlich sind, durch die antioxidative Wirkung länger haltbar sind. Nach seiner Einschätzung nutzt die Pflanze den Chlorophyll-Abbau zu unterschiedlichen Zwecken: In den Blättern zur Zerstörung des Chlorophylls und in den Früchten zur Konservierung. Die kräftigen Farben, die dabei entstehen, sind zumindest bei den Früchten von Vorteil, denn ein roter Apfel fällt mehr auf und lädt eher zum Fressen – und zum Essen – ein als ein grüner. <% image name="Chlorophyll_Obst" %><p> <small> <b>Die Wirkung von Chlorophyll ist im Körper unklar:</b> Entgegen der landläufigen Annahme, alles Grüne sei gesund, ist über die gesundheitliche Wirkung von Chlorophyll erstaunlich wenig bekannt. Klar ist lediglich, dass Chlorophyll als solches eigentlich nicht vom Körper aufgenommen wird. Seine photoaktiven Abbauprodukte wie das Pheophorbid a hingegen sind sogar giftig. Pheophorbid a entsteht entlang des Abbauwegs vom Chlorophyll zu den NCCs. Bei ihm fehlen bereits Magnesium und die fettliebende Seitenkette, allerdings ist das Tetrapyrrol-Ringsystem noch intakt. Erst vor kurzem wurde entdeckt, dass sich der Körper von Säugetieren aktiv vor der Aufnahme von Pheophorbid a schützt. Wissenschaftler um Alfred Schinkel vom niederländischen Krebs-Institut wollten eigentlich herausfinden, was die natürliche Aufgabe eines bestimmten Brustkrebsresistenzgens ist. Dieses Gen kodiert für ein Transport-Protein, das Krebsmedikamente aus den Zellen herausbefördert. Dadurch wirken die Medikamente nicht und die Therapie bleibt erfolglos. Also stellten die Wissenschaftler Mäuse her, denen die Brustkrebsresistenzgene fehlten. Die Mäuse schienen völlig gesund, bis sie eines Tages grünes Alfalfa-Futter zu fressen bekamen. Diejenigen Mäuse, deren Käfige in Nähe der Fenster standen, erlitten starke Lichtschäden. Folgendes stellte sich heraus: In dem grünen Futter war das Chlorophyll durch Enzyme bereits teilweise zu Pheophorbid a zersetzt. Im Gegensatz zum sperrigen Chlorophylmoleküll, kann Pheophorbid a sehr wohl von Zellen aufgenommen werden. Als natürlicher Schutz dienen nun just jene bei den Mäusen ausgeschalteten Transportermoleküle. Ihre Aufgabe ist es, das Photogift wieder herauszubefördern, genau wie sie es auch mit den Krebswirkstoffen tun. Somit hatten die Wissenschaftler unerwarteterweise einen Mechanismus entdeckt, mit dem sich der Körper vor der Aufnahme von phototoxischen Chlorophyll-Abbauprodukten schützt. Die NCCs im Obst hingegen, die nicht mehr photoaktiv sind, könnten sogar eher gesund sein. </small> <small> siehe auch: Angewandte Chemie 119, 8854-9957, 2007 </small> Mehr als nur „Chlorophyll-Müll“

Was die Röntgenbeugung zu leisten vermag

Chemie
02.02.08   von  
Menschen der Forschung: Karl Zojer im Gespräch mit Erich Halwax vom Institut für chemische Technologien und Analytik an der TU Wien. Über Algen als Knochenersatz, Geheimnisse in Zinnsärgen und dem Unterschied zwischen guter und schlechter Patina. Was die Röntgenbeugung zu leisten vermag <% image name="Erich_Halwax" %><p> <small> Erich Halwax: „Die Kristallographie ist aus den Lehrplänen fast schon verschwunden – ein Jammer!“ </small> <i>Auf dem Gebiet der porösen Materialien arbeiten Sie mit dem Kieferchirurgen Rolf Ewers vom AKH zusammen, der eine interessante Entdeckung gemacht hat. Was wird hier erforscht?</i> Professor Ewers hat entdeckt, dass Algen – etwa aus dem Atlantik vor der Bretagne – eine dem menschlichen Knochen sehr ähnliche hochporöse und gleichzeitig mechanisch stabile Struktur aufweisen. Um sie als Kieferersatz einsetzen zu können, muss man die Algen jedoch kristallchemisch verändern – im Wesentlichen wird das Carbonat der Algen (der Calcit) durch Phosphat in Form von Apatit ersetzt. Das geschieht hydrothermal unter Beibehaltung der hohen Porosität der Algen und ist im Detail Inhalt eines Patentes von Ewers. Meine Aufgabe war und ist es, Zwischen- und Endprodukte mittels Röntgenbeugung zu analysieren. Das ist die beste Methode zum Nachweis kristalliner Substanzen, auch von kleinsten Verunreinigungen bis in den Bereich um 0,1 %, sofern sie kristallin sind. <i>Wie finden die modifizierten Algen dann ihre konkrete Anwendung in der Kiefer- bzw. Gesichtschirurgie?</i> Das aus Algen hergestellte Knochenaufbaumaterial wird dem Patienten im Gesichts- und Kieferbereich implantiert. Das umliegende Gewebe macht aus dem Algenmaterial innerhalb weniger Monate gesunden Knochen. <i>Eine interessante Entdeckung haben Sie auch in der Kapuzinergruft gemacht?</i> Im Zuge der Restaurierung der Zinnsärge der Kapuzinergruft – gemeinsam mit der Universität für Angewandte Kunst – bekam ich eine Probe von einem Material zur Analyse, das auf der steinernen Bodenplatte unter dem Sarg gefunden wurde und das nachweislich aus dem Inneren des Sarges stammte. Der Befund aus der Röntgenbeugung war, dass die Probe kristallines NaNO<small>3</small> und KNO<small>3</small> enthält. NaNO<small>3</small> ist im Pökelsalz enthalten. Die Habsburger wussten also bereits im 17. Jahrhundert, wie sie ihre Toten konservieren können. <i>Mit der Universität für Angewandten Kunst arbeiten Sie auch heute noch zusammen?</i> Ja, diese Zusammenarbeit währt mittlerweile bereits seit 14 Jahren. Ein wichtiges Projekt war und ist die Untersuchung natürlicher Patina-Proben und von solchen, die durch künstliche Bewitterung von Kupferblechen hergestellten werden. Die Röntgenbeugung leistet hier unverzichtbare Dienste, weil sie problemlos zwischen den diversen kristallinen Kupfersulfaten unterscheidet, die sich bei Korrosion von Kupfer in saurem Regen (SO<small>3</small> + H<small>2</small>O) bilden können. Die Denkmalschützer unterscheiden zwischen guter und schlechter Patina. Gute Patina besteht aus Brochantit oder Antlerit (das sind basische Cu-Sulfate mit relativ wenig Sulfat), die beide das Objekt – etwa ein Bronzedenkmal – vor weiterer Korrosion schützen. Wird in der Patina aber Chalcanthit (CuSO<small>4</small>.5H<small>2</small>O) nachgewiesen, muss die Patina im Zuge der Restaurierung entfernt werden: Chalcanthit ist aggressiv und frisst sich immer weiter in das befallene Objekt hinein. <i>Sie wenden dabei häufig die so genannte Rietveld-Methode an. Was hat es damit auf sich?</i> Nach der Messung einer polykristallinen Probe liegen die Beugungsdaten in digitaler Form vor – Intensitäten als Funktion des Beugungswinkels 2Theta. Gemessen wird üblicherweise in 2Theta-Schritten von 0,02 Grad, zum Beispiel von 2Theta = 5 bis 2Theta = 70 Grad Cu-Strahlung. Das gemessene Diffraktogramm besteht also hier aus 65 mal 50 = 3.250 Daten. Es enthält die Intensitäten der an der Probe gebeugten Röntgenstrahlen (Röntgenreflexe) über einem Untergrund neben Bereichen, die nur aus Untergrund bestehen. Die Intensitäten der Röntgenreflexe hängen von den kristallinen Substanzen in der Probe ab, und zwar von deren Kristallstruktur und von deren Anteilen in der Probe. Kennt man alle in der Probe enthaltenen kristallinen Substanzen und kennt man ferner möglichst genau deren Kristallstrukturen, dann kann man die Intensitäten der Röntgenreflexe auch berechnen. Die bahnbrechende Idee Rietvelds bestand 1967 darin, das gesamte gemessene Diffraktogramm durch ein Modell zu simulieren, bei dem sinnvolle Annahmen auch über das Beugungsprofil eines einzelnen Reflexes (etwa eine Gauss-Funktion im Falle von Neutronenbeugung) und über den Untergrundverlauf zu machen waren. Die Anpassung des Modells an das gemessene Diffraktogramm erfolgt über ein Least-Squares-Verfahren. Diese Rietveld-Anpassung liefert dem Chemiker wertvolle Daten, unter anderem die quantitative Zusammensetzung der Probe, die Gitterparameter der kristallinen Phasen und deren Kristallitgrößen. Heute gibt es sehr benutzerfreundliche kommerziell erhältliche Rietveld-Programme und die Phasenquantifizierung mit ihnen ist ein Vergnügen – vorausgesetzt, man hat die Probe qualitativ korrekt analysiert, was keinesfalls immer trivial ist. <i>Sie beschäftigen sich auch sehr mit der Automatisierung von Analysenmethoden?</i> Ich habe vor Jahren eine Methode ausgearbeitet und auch ein Computer-Programm dafür geschrieben, bei der das gemessene Diffraktogramm einer Probe simuliert wird – ausgehend von den ebenfalls gemessenen Diffraktogrammen der reinen Substanzen, die in der Probe enthalten sind. Im Vergleich damit ist die Rietveld-Methode zwar ungleich rechenaufwendiger, aber auch ungleich flexibler und leistungsfähiger. Ansonsten betreue ich die Datenbank für die Pulverdiffraktion. Es können jederzeit gemessene oder aus neuen Kristallstrukturen berechnete Diffraktogramme in die bestehende Datenbank aufgenommen werden. Das ist für Routineanalysen von Vorteil und für die Forschung manchmal unabdingbar. <i>Sie sind natürlich auch in der Lehre tätig. Was bringen Sie den Studierenden bei?</i> Die Grundzüge der Kristallographie und die Prinzipien der Röntgenbeugung an polykristallinen Proben sowie ihre Anwendungen in der qualitativen und quantitativen Phasenanalyse. Meine Lehrtätigkeit profitiert auch von der Zusammenarbeit mit ehemaligen Studenten, die heute in der Industrie tätig sind und denen ich bei der Lösung ihrer Probleme behilflich sein kann. Den Studierenden des ersten Studienabschnittes bringe ich die Grundzüge der Strukturaufklärung, demonstriert an einfachen anorganischen kristallinen Substanzen bei, also das, was die Pioniere der Röntgenkristallographie vor 90 Jahren gemacht haben, nur damals eben ohne Taschenrechner oder PC, sondern mit Logarithmentafeln. <i>Was für einen Eindruck haben Sie von den heute Studierenden?</i> Ich habe Studenten sowohl an der TU Wien als auch an der Universität für Angewandte Kunst. Bei den Studierenden von der Angewandten gefällt mir die Neugierde und die Begeisterung für mein Fach. Dass sie von mir auch etwas haben wollen, nämlich die Analyse ihrer Proben bei der Restaurierung von Kunstobjekten, liegt auch in meinem Interesse – ich lerne auch von ihnen. Bei den TU-Studenten, insbesondere bei denen des ersten Studienabschnittes, gibt es ein größeres Gefälle zwischen denen mit schneller Auffassung und denen, die langsamer sind. Mein Problem waren aber noch nie die Studenten. Mein Problem sind die Lehrpläne für die künftigen Chemiker, und in diesen Lehrplänen sehe ich die Kristallographie praktisch nicht mehr vertreten – ein Jammer. <i>Was sagt ein Universitätslehrer zum Thema Gesamtschule?</i> Ich bin offen für die Gesamtschule. Es kommt meines Erachtens langfristig ebenso darauf an, dass eine Gesellschaft ihre Bürger zu Toleranz erzieht wie darauf, dass sie Begabungen fördert.

Von aseptischen Prozessen und Quality by Design

Life Sciences
02.02.08   von  
<a href=http://www.ortner-group.de>Ortner Reinraumtechnik</a>, <a href=http://www.utg.at>UTG Universaltechnik-Maier Industrieanlagenbau</a> sowie <a href=http://www.vtu.com>VTU-Engineering</a> luden zum „Innoforum 2008“ nach Mondsee. Die Anlagenprofis der Pharmabranche diskutierten die Trends der Steriltechnik. <table> <td><% image name="Fritz_Erni" %></td> <td align="right"> Das „Innoforum“ hat bereits Geschichte: Im Zweijahres-Rhythmus versammeln sich Experten der deutschsprachigen Pharmabranche, um gemeinsam elegante Wege zu einer höheren pharmazeutischen Produktivität zu erörtern. Für die ,Big Vision’ des „Quality by Design“ konnten die Veranstalter heuer Fritz Erni gewinnen. Der Leiter der globalen Quality Operations bei Novartis in Basel sagt; „Die Wissenschaft wurde lange hinter Compliance-Vorgaben zurückgedrängt. Jetzt kehrt sie im Zuge der neuen Prozess-Verständnisse wieder zurück.“ Er ist überzeugt, dass die Bemühungen der <a href=http://www.ich.org>ICH</a> immer mehr den Charakter richtungs-weisender Guidelines annehme. Von Q8, Q9 und Q10 ist die Rede. </td> </table><p> <small> Fritz Erni skizziert die Vorzüge, die das Konzept des „Quality by Design“ mit sich bringen könnte. </small> Doch der Reihe nach. Aktuell ist das globale Pharmageschäft rund 700 Mrd $ schwer, wächst jährlich um etwa 6 % und spielt Margen jenseits der 20 % ein. Jedoch: Alleine zwischen 2007 und 2012 verliert ein Umsatzvolumen von etwa 76 Mrd $ den Patentschutz. Pharma-Companies mit „Blockbuster-Giganten“ wie Lipitor, die derzeit noch mehr als 12 Mrd $ Umsatz pro Jahr einspielen, sind so enorm in ihrer Existenz gefährdet. Bei Pfizer etwa liegt der Anteil der nicht mehr geschützten Wirkstoffe bereits nahe der 90 %-Marke. Gleichzeitig schwappt aus den Pipelines nur wenig wirklich Neues auf den Markt: 2007 wurden von der FDA gerade einmal 19 neue Wirkstoffe zugelassen – der geringste Wert seit 24 Jahren. Die sehr hohen Erwartungen in die biologischen Präparate wurden nur teilweise erfüllt. Vor diesem Hintergrund präsentiert Erni die Vision des „Quality by Design“: „Wenn es die Halbleiterindustrie schafft, die Ausschussrate auf eine unter 1 Mio produzierter Einheiten zu beschränken, die Pharmaindustrie jedoch zwischen 5 und 10 % ihres Ausstoßes für Müllverbrennungsanlagen herstellt, dann haben wir in dieser Branche ein enormes Potenzial, die Produktivität zu erhöhen.“ Es kranke in der Pharmaindustrie an der „GMP-Mentalität“ – „jeder Operator könnte eine Produktionsanlage besser einstellen, nur darf er es nicht“ – und dem krampfhaften Festhalten an der Strategie, das Endprodukt anstatt die Prozessqualität zu testen. Die Wissenschaft werde so hinter die Compliance zurückgedrängt, kontinuierliche Verbesserungen würden unterdrückt. <b>Mehr Prozessverständnis.</b> Erni beschreibt das Dilemma: „Die typischen Inhaltsstoffe einer Tablette sind immer dieselben – zu einem Großteil besteht sie aus Laktose und mikrokristalliner Zellulose, ein wenig Stärke sowie einer sehr geringen Menge des jeweils aktiven Wirkstoffes. Wie diese Ingredienzien allerdings beim Herstellen der Tablette tatsächlich in Mischung geraten, das wissen wir noch viel zu wenig.“ Bei diesem und zahlreichen anderen Prozessen gelte es daher nun, (1) alle kritischen Parameter aufzudecken, (2) das Beherrschen ihrer Variabilität im Prozess sicherzustellen und (3) die gewünschte Produktqualität durch einen definierten „Design-Space“ zuverlässig und akkurat einzustellen. Derzeit sind freilich noch bei weitem nicht alle notwendigen Tools des dafür nötigen Werkzeugkastens ausreichend entwickelt. Gelänge es, den Ausschuss in der Pharmaindustrie ebenso auf 1 ppm zu reduzieren, „so würden sich Kosteneinsparungen zwischen 10 und 20 % einstellen“, ist Erni überzeugt. <% image name="CFD_Simulation" %><p> <small> „Die Physik voraussagen“: Neue Simulations-Tools von Ortner optimieren Sterilräume bereits vor dem Bau. </small> <b>Design-Space.</b> Voraussetzung für den sinnvollen Einsatz der „Quality by Design“ ist allerdings ein „Design-Space“, der nicht bloß im Pilotmaßstab das hält, was er verspricht, sondern unabhängig von Anlagengröße und Wirkstoff angewendet werden kann. Dazu bieten sich Computational Fluid Dynamics (CFDs) an. Dabei werden Strömungsgebiete in sehr viele Einzelzellen zerlegt und in Folge Bilanzen über jede einzelne Zelle errechnet. <table> <td><% image name="Strahlduese" %></td> <td align="right"> Für die Begasung und Entlüftung im Rahmen der Sterilisation via Wasserstoffperoxid – zur Biodekontamination werden entweder H<small>2</small>O<small>2</small>, Peressigsäure (CH<small>3</small>OCOOH) oder Chlordioxid (ClO<small>2</small>) eingesetzt – hat Ortner ein solches Simulationswerkzeug entwickelt und für Reinraumschleusen auch schon validiert.<p>Ortner-Experte Hubert Jarnig spricht von „hochkomplexen Berechnungen mit 8 partiellen Differential-Gleichungen“ und schwärmt von der Möglichkeit, Schleusen-Kammern und künftig auch Isolatoren und ganze Räume bereits vor dem Bau perfektionieren zu können. </td> </table><p> „Gemeinsam mit unserer programmierbaren H<small>2</small>O<small>2</small>-Strahldüse lassen sich so 2/3 der Kosten bei der Zyklusentwicklung einsparen – die optimierten Strömungs-Verhältnisse sorgen zudem im Betrieb für wesentlich schnellere Prozesse.“ <b>Clean Areas.</b> Von den Fortschritten in der aseptischen Abfüllung weiß Martin Kern, der Leiter der pharmazeutischen Prozesse bei Octapharma, zu berichten. Er hat das rund 6,5 Mio € teure Upgrade der Wiener Octapharma-Produktion um eine Gefriertrocknungslinie, eine Biodekontamination per H<small>2</small>O<small>2</small> sowie deren Roboter-Bestückung geleitet. Octapharma wird damit in wenigen Wochen über die erste vollautomatische aseptische Abfüllung Österreichs verfügen – weltweit sind derzeit etwa 100 solcher Systeme in Betrieb, davon 60 % in den USA. Zum Einsatz kommt dabei auch eine drahtlose Temperaturübertragung – ein kleiner Fühler wird dabei direkt in das mit dem Produkt befüllten Fläschchen gegeben, der sodann via 2,4 GHz seinen Messwert direkt in das Prozessleitsystem abgibt. Eine derart realisierte aseptische Befüllung würde zwar höhere Investitionen erfordern, allerdings auch den konventionellen Reinraum überflüssig machen; „zudem lässt sich die Anlagenverfügbarkeit durch einen Kampagnenbetrieb erhöhen und die Personalkosten durch den hohen Automationsgrad senken“, so Kern. <table> <td><td><% image name="Vial" %></td> <td align="right">Generell sind aseptische Herstellungsprozesse durch die starke Zunahme an biotechnisch hergestellten Produkten – Vakzine und Proteine also – gefragt: Wurden 1990 gerade einmal 20 % der Medikamente gefriergetrocknet, liegt der Anteil an Lyophilisaten heute bereits bei rund 40 %. In den entsprechenden „Anlagen für Vials & Spritzen“ werden immer empfindlichere Produkte produziert – Produkte, die auch ein ideales Nährmedium für Mikroorganismen abgeben. In diesen Anlagen „ist die Integration von Robotersystemen – auch der Handgriff in den Isolator soll heute noch vermieden werden – sowie eine exzellente Maschinengängigkeit sehr wichtig“, so Kern, „ebenso wie getrennte CIP-/SIP-Prozesse und überaus aufwändige Messdatenerfassungen“. Insgesamt stehe beim Design von Reinräumen bzw. Barrier Isolation Technologies längst der Prozess und nicht mehr die Technologie im Vordergrund. „Selbst die überaus unangenehmen Overalls des Bedienpersonals werden nun dank neuer Fasern bequemer“, so Kern. </td> </table><p> <small> Medikamente werden immer öfter in Form von Vials oder Spritzen gefertigt. </small> Von aseptischen Prozessen und Quality by Design

Neues Wissen für kleinere Handyplatinen

Wissenschaften
02.02.08   von  
Vor einem halben Jahr startete Herbert Hutter mit Unterstützung der AT&S an der TU Wien das CD-Labor für Oberflächen- und Grenzflächenanalytik. Sein Auftrag: Hochpräzise Werkstoff-Analysen via TOF-SIMS sollen die Grundlagen für noch kleinere Leiterplatten schaffe – ein wertvolles Wissen für den steirischen Leiterplattenhersteller <a href=http://www.ats.net>AT&S</a>. Neues Wissen für kleinere Handyplatinen <% image name="Leiterplatten" %><p> <small> Leiterplatten aus der Steiermark: Der Trend zur Miniaturisierung verlangt neue Produktionsverfahren – und exakte Analysen. </small> Das Prinzip ist einfach: „Wir sehen nach, welche Elemente wo sind. Und wir wollen wissen, in Abhängigkeit wovon sie dort sind, was sie dort tun.“ Herbert Hutter spricht von Leiterplatten. Sie verbinden aktive und passive Komponenten und stellen somit die Basis aller elektronischen Geräte dar. Es sind komplexe Verbundwerkstoffe aus Metallen und Polymeren (in der Regel sind es heute Kupferleitungen auf einer Harzbasis), die insbesondere als Handy-Platinen einem steten Miniaturisierungs-Zwang unterliegen: „Die Belastungen dieser in mehr als 20 Schichten aufgetragenen Leiterplatten nimmt entsprechend zu, je kleiner und flexibler sie gestaltet werden“, erklärt Hutter. Zudem werden die Platinen nicht nur wesentlich kompakter, sondern auch vielfach funktioneller: „Mitunter wird die Intelligenz ganzer Chips bereits in die komplexe Struktur der Leiterplatten integriert.“ <b>Neue Phänomene verstehen.</b> AT&S hat sich eine weltweit führende Stellung als Hersteller solcher Multilayer-Leiterplatten erarbeitet. Um diese Marktposition zu behaupten, muss AT&S einem ähnlichen Innovationsdruck wie in der Halbleiterindustrie standhalten. Verbesserte Analyse-Techniken, um neue Produktionsschritte zu entwickeln, sind daher wichtig. Aus diesem Grund unterstützt und finanziert AT&S auch in Kooperation mit der Christian Doppler Gesellschaft das neue CD-Labor zur Grundlagenforschung für die Weiterentwicklung von Leiterplatten. Es sind völlig neue Phänomene wie die Elektromigration – wenn sich also Metallatome in Anwesenheit elektrischer Felder zu bewegen beginnen –, die nun verstanden werden müssen. Einfacher ausgedrückt: Je kleiner die Platinen werden, desto enger liegen die Leiterbahnen aneinander – und desto größer wird daher die Gefahr eines Kurzschlusses. <% image name="Hutter_Herbert" %><p> <small> Herbert Hutter vor dem neuen TOF-SIMS-Gerät an der TU Wien. </small> Das Mittel der Wahl bei den Analysen der Leiterplatten ist ein TOF-SIMS (Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometer), bei dem sowohl die dreidimensionalen Verteilungen von Spurenelementen als auch organische Oberflächen charakterisiert werden können. Die „SIMS-Gruppe“ der TU Wien beschäftigt sich bereits seit mehr als 20 Jahren mit diesem Analyseverfahren und betreibt das einzige TOF-SIMS-Instrument an einer österreichischen Universität. Seit wenigen Monaten wird am Institut für Chemische Technologien und Analytik an einem neuen, rund 800.000 Euro teuren Gerät der deutschen ION-TOF experimentiert – Hutter hat die Mittel dafür 2005 im Rahmen der UNIINFRASTRUKTUR III Maßnahme des Bundes bewilligt bekommen. Die SIMS-Technologie ist vor allem in der Halbleiterindustrie weit verbreitet, wo die Messungen damit die Grundlagen für extrem hohe Reinheiten liefern. Der Vorteil dieses Analyseverfahrens: Alle Massen über 1 ppm können damit gemessen werden, zudem eignen sich hier auch nichtleitende Proben. „Der molekulare Aufbau der ersten Atomlage einer Festkörper-Oberfläche lässt sich damit exakt nachweisen“, sagt Hutter. Zahlreiche Punkt-Messungen aneinandergereiht ergeben sodann ein entsprechendes Bild, das sich – dank einem sehr sanften Abtragen der Atomlagen – auch in die Tiefe projizieren lässt. 3D-Bilder mit einer Tiefenauflösung von weniger als 0,5 Nanometer werden so möglich. <b>Neue Forschungswege aufzeigen.</b> Die analytische Unterstützung via TOF-SIMS soll letztlich die Produktionstechnologie bei AT&S entsprechend weiterentwickeln: „Wenn wir exakt aufklären können, welche Verunreinigungen woher kommen, so kann das in Folge die richtigen Forschungswege aufzeigen – „das kann bedeuten, dass etwa statt einer Optimierung von Reinigungsanlagen ein völlig anderer Werkstoff angezeigt ist“. Anstatt der bereits sehr gut untersuchten Metall-Metall-Grenzflächen geht es Hutter und seinem Team um die Grenzflächen zwischen unterschiedlichen Polymeren und Metallen sowie zwischen Polymeren und Keramik. Für die Quantifizierung organischer und anorganischer Kontaminationen auf unterschiedlichen Substraten werden Vergleichsmessungen mit anderen hoch spezialisierten analytischen Verfahren vorgenommen. Dafür braucht es weitere Gerätschaften, wie sie an der TU Wien allesamt vorhanden sind: Elektronenmikroskope oder Infrarotspektrometer etwa. Die so entstehenden vieldimensionalen Daten sollen sodann unter Berücksichtigung der speziellen Anforderungen der TOF-SIMS-Messungen ausgewertet werden. Ein interaktives Programm zur Messdatenverarbeitung und Visualisierung, an dem das CD-Labor derzeit arbeitet, soll künftig als Open Source allen TOF-SIMS Betreibern zur Verfügung gestellt werden. <small> <b>Die im TOF-SIMS</b> eingebaute Ionenquelle (eine Liquid Metal Ion Gun) beschießt die Probe in einer äußerst kurzen Zeitspanne mit Primärionen (aus einer Bismut-Quelle) und schlägt dabei wenige Sekundärionen aus dieser heraus. Die Atome werden „zerstaubt“, die Experten sprechen von so genanntem Sputtern. In einem konstanten elektrischen Feld werden die Sekundärionen beschleunigt, durchfliegen anschließend eine feldfreie Zone und werden schließlich detektiert und in Zeitkanälen aufsummiert. Dabei gilt: Die Masse der Ionen ist proportional zum Quadrat der Flugzeit. </small>

Entfaltung und Spaltung in der Gasphase

Life Sciences
02.02.08   von  
Die START-Preisträgerin Kathrin Breuker wird bald nicht mehr so viel reisen müssen. Bisher musste die Physikerin, die eigentlich am Institut für Organische Chemie der Uni Innsbruck arbeitet, zum Messen immer in die USA fliegen. Sie nutzt dort ein spezielles Massenspektrometer der Cornell University. Doch nun trägt Österreichs höchste Auszeichnung für Nachwuchswissenschaftler dazu bei, ein solches FT-ICR-Gerät in Tirol zu finanzieren. Ein Portrait von Carola Hanisch. <% image name="Kathrin_Breuker1" %><p> <small> Kathrin Breuker erforscht die Struktur großer Biomoleküle im Vakuum. </small> Die deutsche Forscherin, die auch schon mit dem Novartis-Preis für Chemie ausgezeichnet wurde, untersucht mit dem FT-ICR-Gerät, das Kürzel steht für Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz, die 3D-Struktur von Proteinen und Nukleinsäuren in der Gasphase. Ihr Forschungsansatz ist äußerst raffiniert. Wenn sie ihn erklärt, muss Kathrin Breuker daher vor allem Fragen beantworten, die mit „wie“ und „warum“ beginnen. Denn zum einen erscheint die Massenspektrometrie auf den ersten Blick gar nicht zum Studium von Struktur geeignet. Mit dieser Messmethode ermittelt man schließlich das Verhältnis von Masse zur Ladung eines Ions in der Gasphase. Die dreidimensionale Struktur eines gasförmigen Molekülions hat aber keinen Einfluss auf das Masse/Ladungsverhältnis und kann aus dem Spektrum nicht abgeleitet werden, zumindest nicht direkt. Zum anderen ist der Gaszustand für Biomoleküle unnatürlich: Schließlich spielt sich das Leben im flüssigen Milieu ab. <% image name="Kathrin_Breuker" %><p> <small> Arbeit am FT-ICR-Gerät – ein solches soll nun auch in Tirol angeschafft werden. </small> Dennoch ist die Massenspektrometrie seit den 1980er Jahren zu einer der wichtigsten Methoden bei der Analytik von Biomolekülen geworden. Damals machte es die Erfindung sanfter Desorptions- und Ionisierungstechniken wie der Elektrospray-Ionisation (ESI) möglich, auch sehr große Moleküle unzerstört in die Gasphase zu bringen. Eine spezielle Variante der ESI ist die „native Elektrospray-Massenspektrometrie“, mit der Biomoleküle, biologische Komplexe und sogar Viren – intakt und ionisiert – in das Vakuumsystem des Massenspektrometers gesprüht werden können. <b>Ionen im Magnetfeld.</b> In einem FT-ICR Instrument werden die Ionen dann in eine sogenannte ICR-Zelle geleitet. Es ist vor allem diese Zelle, die das Gewinnen von Strukturinformationen möglich macht, denn darin können die Ionen lange Zeit durch die Wirkung von Magnetfeldern festgehalten und verschiedenen Experimenten unterzogen werden. Zum Beispiel wird ihnen Energie zugeführt, indem sie mit einem IR-Laser bestrahlt werden oder mit chemisch neutralen Gasen zusammenstoßen – die erhöhte Energie kann dann ihren Zerfall bewirken. Anhand der Veränderungen, die je nach Experiment im Massen-Spektrum auftauchen, lassen sich Rückschlüsse auf die Ausgangsstruktur ziehen. Umstritten ist aber, ob die Strukturen in der Gasphase überhaupt dieselben sind wie die in Lösung. Kathrin Breukers Forschungsergebnisse deuten nun aber darauf hin, dass die Gasphasen-Struktur von Proteinen völlig anders sein kann als jene in Lösung. Für die native Elektrospray-Massenspektrometrie ist es daher äußerst wichtig herauszufinden, ob und nach welchen Regeln sich Moleküle beim Übergang in der Gasphase verändern. Ähnliches gilt auch für ein anderes massenspektrometrisches Verfahren, das ebenfalls mit FT-ICR-Geräten durchgeführt werden kann, die Top-Down-Massenspektrometrie. Dieses Verfahren dient eigentlich nicht der Aufklärung von 3D-Strukturen – es geht vielmehr darum, die Abfolge von Aminosäuren und die Modifikationen eines Proteins zu bestimmen. Und doch kommt man auch hier um die Gasphasenstrukturen nicht herum. Bei der Top-Down-Massenspektrometrie werden Proteine wiederum mit Elektrospray-Ionisation in die Gasphase gebracht. Allerdings handelt es sich um zuvor in Lösung denaturierte Eiweiße, deren dreidimensionale Struktur also bereits zerstört wurde. In einem ersten Schritt wird die Masse des ganzen Molekülions bestimmt. Daraus lässt sich unter anderem die Anzahl der Modifikationen erkennen. Modifikationen sind kleine Molekülgruppen, die an das Protein angehängt wurden, um seine Funktionsweise und Aktivität zu regulieren. <b>Protein-Puzzle.</b> Für den zweiten Schritt des Verfahrens werden die Molekülionen wiederum in der ICR-Zelle eingefangen, wo sie mit relativ rabiaten Techniken in Bruchstücke zerlegt werden. Breuker verwendet unter anderem die Elektronen-Einfangs-Dissoziation (ECD), bei der die Biomolekülionen mit von außen zugeführten Elektronen reagieren. Dadurch wird das Rückgrat des Proteins an zufälligen Stellen gespalten. Anschließend werden die Fragmente massenspektrometrisch vermessen. Bei der Auswertung versucht man dann, wie bei einem Puzzle, herauszufinden, wie die Bruchstücke zusammenpassen. So ergibt sich schließlich die exakte Abfolge der Aminosäuren. Dabei ist es von Vorteil, dass FT-ICR-Geräte Spektren mit extrem hoher Auflösung liefern. Auch kann man erkennen, an welchen Stellen Modifikationen bestehen. Proteine bis zu einer Masse von etwa 15kDa können auf diese Weise komplett sequenziert und charakterisiert werden. Das Verfahren ist sehr wichtig für die Proteomik, also die Charakterisierung aller in einer Zelle oder einem Organismus vorhandenen Proteine. Allerdings macht die Methode bei größeren Biomolekülen Schwierigkeiten: Häufig tauchen im Spektrum nur Fragmente aus den Endbereichen des Moleküls auf. Die Mitte bleibt unzerteilt. Hier kommt nun wieder die Gasphasenstruktur ins Spiel. Große Proteine nehmen nämlich offensichtlich, obwohl sie in Lösung denaturiert wurden, im Gaszustand eine komplizierte dreidimensionale Struktur an. Die verknäuelten Bereiche lassen sich nicht in Bruchstücke zerlegen – sie müssten erst entwirrt werden. Dann könnte auch die vollständige Sequenzierung sehr großer Biomoleküle gelingen. Da allerdings die Strukturen von Biomolekülen in der Gasphase bisher kaum bekannt sind, fehlen entsprechende Strategien. Von der Weiterentwicklung analytischer Methoden einmal abgesehen, hat Kathrin Breuker noch eine dritte Motivation, sich für Gasphasenstrukturen zu interessieren: pure Neugier. In natürlicher, wässriger Umgebung wird die Struktur eines Moleküls durch eine unüberschaubare Vielfalt an Wechselwirkungen mit seiner Umgebung beeinflusst. Im Vakuum hingegen ist die Struktur frei von äußeren Einflüssen – und damit für die Physikerin per se interessant. <b>Stabilitäten auf den Kopf gestellt.</b> Um Strukturinformation zu erhalten, hat Breuker die Elektronen-Einfangs-Dissoziation (ECD) einfach umfunktioniert. Das Problem bei der Top-Down-Methode war ja, dass sich große Moleküle in der Gasphase zusammenfalten und dass die ECD dadurch keine Fragmente liefert. Umgekehrt heißt das aber, dass man mit Hilfe der ECD-Technik nachweisen kann, ob und an welcher Stelle ein Molekül gefaltet ist. So hat Breuker herausgefunden, dass sich die stabile Gasphasestruktur des Proteins Ubiquitin durch Energiezufuhr in einem dreistufigen Prozess entfaltet. Bei der Analyse des Proteins Cytochroms c hat sie zudem ein äußerst kompliziertes Phänomen entdeckt, bei dem die zur Aufspaltung benötigten Elektronen vom Molekül selbst geliefert werden – ohne äußeren Beschuss. Diese Technik hat sie native ECD genannt. Dabei hat sich gezeigt, dass just jene durch hydrophile Wechselwirkungen stabilisierten 3D-Strukturen die stabilsten sind, die im wässrigen Milieu am leichtesten zu lösen sind. Hingegen werden die in Lösung äußerst widerstandsfähigen hydrophoben Wechselwirkungen in der Gasphase drastisch geschwächt. Die Stabilitäten sind also auf den Kopf gestellt. Diese Erkenntnis bedeutet, dass in der Gasphase andere Wechselwirkungen strukturbestimmend sind, und dass daher auch die Gasphasenstrukturen von Proteinen –zumindest nach Erreichen eines Gleichgewichtszustands– durchaus anders sein können als im natürlichen Medium. Bei Nukleinsäuren hingegen, so schlussfolgert Breuker, könnte die natürliche Struktur in der Gasphase besser erhalten bleiben. Denn bei ihnen wird die Struktur stärker von hydrophilen Wechselwirkungen bestimmt. Die Innsbrucker Wissenschaftlerin will sich daher in Zukunft verstärkt den Nukleinsäuren in der Gasphase widmen. <blockquote><small> <b>Bei der Elektrosprayionisation</b> werden Ionen unter Atmosphärendruck erzeugt. Dabei wird eine Analytlösung durch eine Metallkapillare geleitet, an deren Spitze eine Spannung angelegt ist, wodurch sich ein elektrisches Feld zwischen der Kapillare und einer Gegenelektrode bildet. Dieses durchdringt die Analytlösung und in ihr befindliche Ionen bewegen sich auf die Gegenelektrode zu. Dabei bildet sich an der Spitze der Kapillare ein Überschuss gleichartig geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und als feines Aerosol aus der Kapillare austreten. </small></blockquote> Entfaltung und Spaltung in der Gasphase

February 1st

Allergene Wirkung von Aspergillus versicolor bewiesen

Life Sciences
01.02.08   von  
Forschern des Helmholtz-Zentrums für Umweltforschung (<a href=http://www.ufz.de>UFZ</a>) und des Erfurter Instituts für Umweltmedizin gelang erstmals der Nachweis der allergenen Wirkung von einzelnen Proteinen des weit verbreiteten Schimmelpilzes Aspergillus versicolor. Allergene Wirkung von Aspergillus versicolor bewiesen <% image name="Aspergillus_versicolor1" %><p> <small> Die blauen Linien auf der durchsichtigen Folie, die Martin von Bergen gegen das Licht hält, enthalten Informationen über Proteine, die in den Sporen von Aspergillus versicolor vorkommen. &copy; André Künzelmann/UFZ </small> <% image name="Aspergillus_versicolor" %><p> <small> Den Schimmelpilz Aspergillus versicolor findet man sehr häufig auf Lebensmitteln, an Wänden und im Hausstaub in Innenräumen. </small> <table> <td width="120"></td><td> Schätzungsweise 5 % aller Deutschen leiden an einer allergischen Reaktion, die durch Schimmelpilze in Innenräumen hervorgerufen wird. Bei etwa 80 % allen Pilzbefalls in feuchten Zimmerecken ist der Pilz Aspergillus versicolor vertreten. </small></td> </table> Die Identifizierung der 7 wichtigsten Allergene von Aspergillus versicolor war nicht ganz einfach, gelang folgendermaßen: Die Sporen von Aspergillus versicolor wurden vom Team um Martin von Bergen in einzelne Eiweiße zerlegt und mit verschiedenen Methoden als Strichcode sowie verfeinert als Spots auf einem Gel aufgetrennt und auf eine festere Membran übertragen. Anschließend ließen die Forscher das Blutserum von Allergikern auf die Proteinspots auf der Membran einwirken. Dabei binden die Antikörper, die durch eine Allergie gebildet werden, an die allergenen Proteine. Diese Bindung wird mit weiteren Antikörpern nachgewiesen und einem Enzym optisch sichtbar gemacht. So wird ein Feld voller großer und kleiner Pünktchen sichtbar, das zeigt, wo sich Pilz-Eiweiße befinden, die mit den Antikörpern aus dem Serum reagiert haben. Um sodann festzustellen, welche Eiweiße sich hinter den Pünktchen auf der Membran verbergen, griffen die Biochemiker wieder zu den auf dem Gel aufgetrennten, aber von Antikörpern und Farbstoffen unberührten Eiweißen zurück. Da die Forscher inzwischen wissen, wo die Gefährlichen platziert sind, stanzten sie die Spots dort punktgenau aus. Die winzige Proteinmenge, die sich in dem stecknadelkopfgroßen Stück Gel verbirgt, wird in noch kleinere Peptide zerlegt. Diese werden sodann im Massenspektrometer vermessen und wie ein Fingerabdruck mit einer Datenbank abgeglichen, in der alle bekannten Proteine gespeichert sind. Jetzt will von Bergen die Untersuchungsmethode noch vereinfachen: "Noch heuer werden wir einen Test vorlegen, der in jedem Labor problemlos durchführbar ist." Das so zu erzielende Testergebnis ginge weit über die bisher möglichen Aussagen hinaus, denn nun könnten die Identität der auslösenden Pilzart und des einzelnen Eiweißes bestimmt werden.

Seiten