Chemiereport_2016-3

70 AustrianLifeScienceschemiereport.at 2016.3 CHEMIE & TECHNIK Bild:WolfgangBrodacz Trennsäule retardiert bleiben, bis die Lösungsmittel-Zusammensetzung stark genug für deren Elution ist. Denn nur wenn die Analyten durch die Säule wan- dern, sind sie den Fluktuationen der Fluss- rate ausgesetzt. Es ist daher für die Retentionszeit nur ein absolutes Toleranz-Kriterium ange- messen. Bei aktueller Hardware mit kon- stanter Säulen-Temperatur sind üblicher- weise +/– 0,1 Minuten Toleranz ausrei- chend. Für die temperaturprogrammierte Gaschromatographie ergaben die umfang- reichen Messprogramme von Hans Mol ganz ähnliche Ergebnisse, sodass die Schlussfolgerungen sowohl für LC als auch für GC gelten. Das belegt auch die grafische Darstellung der Peak-Erken- nungsfenster im GC-ECD-Chromato- gramm von derivatisierten Mykotoxinen auf einer unpolaren Säule in Bild 3 . Während die schwarz markierten Fensterbreiten (entspricht der Regelung 2002/657/EC) viel zu groß sind und sich teilweise über zwei Peakbereiche (D, E) erstrecken, ist im Routinebetrieb des Autors ein absolutes Peakfenster von +/– 0,1 Minuten ausreichend (rote Markie- rung). In diesem Beispiel würde darüber hinaus eine Störsubstanz den Analyten B infolge der allzu großzügigen Toleranz vortäuschen (blauer Erkennungsbereich vs. rotes Erkennungsfenster). Die grün markierte Retentionszeit-Referenzsub- stanz Mirex dient auch zur Kontrolle der Quantifizierung (von der Injektion bis zum ECD-Response). Auch relative Retentionszeiten sind für Gradientenelutionen nicht sinnvoll, weil relative Kriterien nur dann angebracht sind, wenn die Abweichung tatsächlich mit der Retentionszeit ansteigt. Die Ver- wendung von relativen Retentionszeiten bringt, egal ob mit relativer oder absolu- ter Toleranz, keine signifikanten Verbes- serungen der Erkennungs-Präzision in der Chromatographie. Es gibt daher auch keine Rechtfertigung, bei einer relativen Retentionszeit-Messung noch strengere Kriterien anzuwenden als bei den absolu- ten Retentionszeiten. Ausnahme: Isotopenmarkierte Standards Es gibt jedoch eine sehr empfehlens- werte Ausnahme: Isotopenmarkierte interne Standards verhalten sich prak- tisch gleich (C13-Markierung) oder sehr ähnlich (Deuterierung) wie deren native Zielanalyten und zählen daher zur Königsklasse bei der massenspektrome- trischen Quantifizierung. Neben ihrer Hauptfunktion, der Kompensation von Matrixeffekten jeder Art, stellen sie auch die beste Korrekturmöglichkeit für indivi- duelle Retentionsschwankungen dar. Ins- besondere C13-markierte Analoge zeigen völlig idente Retentionszeiten bei GC- und HPLC-Trennungen, da sie einem wesent- lich geringeren Isotopeneffekt unterlie- gen als deuterierte Analoge, die merkliche Retentionsunterschiede aufweisen. Obwohl nicht immer für alle Zielanalyten (z. B. Pestizidanalytik) lückenlos erhält- lich, so sind mit zunehmender Verbrei- tung von MS-Methoden auch zunehmend mehr gelabelte Standards verfügbar. Durch die individuelle Korrektur mit z. B. voll C13-markierten Mykotoxin-Analogen (Bild 4 ) kann die Retentionszeit-Toleranz in der Routineanalytik des Autors sogar auf z. B. +/– 0,05 Minuten (drei Sekunden; absolut) reduziert werden. Bei Realproben können darüber hin- aus bestimmte Umstände zu zusätz- lichen Variationen der Retentions- zeit-Abweichungen beitragen. In der Gaschromatographie zum Beispiel führen Überladungen der stationären Phase zu Veränderungen der Peakform und in der Folge auch zu Retentionszeit-Differenzen. In der HPLC wiederum sind besonders bei pH-sensitiven Analyten schon geringe pH-Unterschiede kritisch, die ebenfalls zu substanzspezifischen (nicht allgemeinen) Retentionszeit-Verschiebungen führen können. Die grundsätzliche Möglichkeit, dass oben genannte Sonderfälle auftreten können, muss vom erfahrenen Analytiker aber immer im Auge behalten werden. Nur mit isotopenmarkierten internen Standards können selbst solch außerge- wöhnliche Abweichungen automatisch erkannt und sicher korrigiert werden. Fazit und Empfehlung Bei der Multikomponentenanalytik mittels Gradienten-(U)HPLC bzw. in der temperaturprogrammierten Gaschro- matographie ist die Variation der Reten- tionszeit unabhängig von der Retentions- zeit. Die Toleranz für die Retentionszeit ist daher als absoluter Wert anzugeben und in vielen Fällen ist eine Abweichung von +/– 0,1 Minute innerhalb einer Sequenz grundsätzlich erreichbar. Relative Reten- tionszeit-Regelungen bringen dabei kei- nen wesentlichen Vorteil, es sei denn, für jeden Zielanalyten stehen z. B. C13-mar- kierte interne Standards zur Verfügung. Für den ungeregelten Bereich kann für das chromatographische Erkennungs- fenster ein absoluter Wert im Bereich von +/– 0,1bis0,2Minutenempfohlenwerden. Fußnoten 1 H.G.J. Mol, et al.: „Identification in residue analysis based on liquid chromatography with tandem mass spectrometry: Experimen- tal evidence to update performance criteria“, Analytica Chimica Acta 2015, Volume 873, 11. Mai 2015, S. 1–13 2 H.G.J. Mol, et al.: „Identification criteria for determination of mycotoxins in food and feed“, EURL-workshop mycotoxins, Geel, 15.–16. Oktober 2014 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 NIV DON FusX 3ADON AflB1 DAS 15ADON AflG2 MAS AflG1 AflB2 FumB1 HT-2 T-2 FumB2 ZON OAT LC-MS/MSMRM-Response Time, min 4 HPLC-MS/MS-Chromatogramm von 17 nativen Mykotoxinen (blau) und 13 voll-13C-mar- kierten Mykotoxinen (rot) mit absoluter Retentionszeitübereinstimmung (C18 150*4,6mm; 5µm; 1 ml/min Methanol/Wasser-Gradientenelution) 4.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.011.512.012.513.013.514.0

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