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Chemiereport_2016-4

56 AustrianLifeSciences chemiereport.at 2016.4 CHEMIE & TECHNIK Bild: Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hans Mol (RIKILT) Ratio-Überprüfung sind nur chromatographische Peaks aus MRM-Aufnahmen bzw. EIC (Extracted Ion Chromatogram) zuläs- sig. Ein simpler Vergleich der m/z-Abudance aus Einzel-Scans od. Spektren ist keinesfalls ausreichend, da auch die Peakformen und die zeitgleiche Überlappung zusammengehörender Ionenspuren-Peaks zu überprüfen sind. Ion Ratio-Kriterium Wie zu erwarten, sinkt der Anteil an falsch-negativen Resulta- ten mit breiter werdender Toleranz für das Ionenverhältnis. Wenn jedoch die beiden MRM-Spuren mit guter Qualität erfassbar sind, hat das Toleranzausmaß nur mehr einen geringen Einfluss auf die falsch-negative Rate. Die Ion-Ratio-Toleranz spielt aber eine große Rolle, wenn auch nur ein Übergang schlecht messbar ist. Deshalb sind großzügigere Toleranzen vorteilhaft, wenn bei geringen S/N eine Reduktion von falsch-negativen Ergebnissen erzielt werden soll. Bei zu großzügigen Ion Ratio-Toleranzen steigt allerdings auch die Gefahr für falsch-positive Identifizierungen an. Weitere auf- wendige Überprüfungen mit z. T. alternativen Analyseverfahren ergaben, dass bei der Pestizid-Testanordnung von Hans Mol keine fasch-positiven Ergebnisse festgestellt werden konnten.Das ange- strebte Ziel sollte sein, dass falsch-positive Befunde idealerweise eliminiert werden, und dass die falsch-negativen zumindest akzep- tabel gering gehalten werden (z.B. unter 5 %) bleiben. Um der Frage nachzugehen, welche Übereinstimmungen zwi- schen MRM-Verhältnissen von Lösungsmittel-basierten Kali- brier-Standards und jenen von Realproben-Extrakten in der Routinepraxis erwartet werden dürfen, wurden von Mol verschie- denste statistische Betrachtungen durchgeführt. Letztlich ergibt sich aus dem umfangreichen Datenmaterial vom Idealfall bis zum „worst case“ ein Toleranzbereich von ca. +/- 21 % bis +/- 45 %. Damit ist auch die aktuelle Abänderung des SANCO-Dokumentes für die Pestizid-Analytik zu erklären, bei dem die tolerierbare Abweichung mit +/- 30% fixiert wurde (SANCO/12571/2013). Fazit und Empfehlung Durch die umfangreichen Experimente wurde belegt, dass LC-MS/MS Systeme auch bei geringem Clean up-Aufwand hoch- selektive Bestimmungsmethoden ermöglichen. Die Variation der Ionenverhältnisse hängt hauptsächlich von S/N der Produkt-Io- nen ab und nicht wie angenommen vom relativen Verhältnis der beiden Signale. Folgerichtig ist eine konstante Abweichung in Prozent des Referenz-Ionenverhältnisses (Mittelwert aller LM-Kalibrierstandards derselben Sequenz) zu definieren. Mit +/- 45 % Toleranz sollte der Großteil der bei praktischen Proben auftretenden Variationen abgedeckt sein. Da in der Versuchsan- ordnung damit auch keine nachweisbaren falsch-positiven Ergebnisse in Blank-Extrakten aufgetreten sind, kann dieser Toleranzbereich als „Fit for Purpose“ gelten. Wenn keine vorgegebenen Regelungen bestehen, kann fol- gende Vorgehensweise empfohlen werden: Das chromatographische Erkennungsfenster sollte ein absolu- ter Wert im Bereich von +/- 0,1 bis 0,2 Minuten sein. Alle MRM-Peaks liegen zeitlich exakt übereinander und die Signalstärke liegt über dem Reportinglimit. Vergleich der relativen Intensität der beiden Produkt-Ionen mit dem Referenzwert für das Soll-Ionenverhältnis. Bei Ion Ratio-Abweichungen über 30 % sollte eine Überprü- fung auf Interferenzen etc. stattfinden, da nicht nur die Identi- fizierungssicherheit geringer wird, sondern auch die Quantifi- zierung beeinträchtigt sein kann. Fußnoten 1 H.G.J. Mol, et al., „Identification in residue analysis based on liquid chromatography with tandem mass spectrometry: Experimental evidence to update performance criteria“; Analytica Chimica Acta 2015; Volume 873, 11 May 2015, Pages 1–13 2 H.G.J. Mol, et al., „Identification criteria for determination of mycotoxins in food and feed“; EURL-workshop mycotoxins, Geel, 15-16 October 2014 matrix solvent 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 0.E+00 2.E+06 4.E+06 6.E+06 8.E+06 Abweichung der Ion Ratios vom Soll (Durchschnitt aller LM-Standards) Fläche des Übergangs mit der geringsten Intensität deviation ≤ ± 20 % ± 20 – 25 % ± 25 – 30 % ± 30 – 50 % > ± 50 % % of all myco/matrix 79.5 9.1 5.6 4.0 1.8 3 Plot der relativen Abweichungen der Signalverhältnisse gegen die absoluten Signalintensitäten zeigt eine deutliche Abhängigkeit der Ion Ratio-Differenzen von der Signalqualität. 0.E+002.E+064.E+066.E+068.E+06

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